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F: Ich versuche ein natives Gel zu verwenden. Ich verwendete den EZ-Proteinmarker, den ich normalerweise für SDS-PAGE verwende. Die rote Bande und die obere blaue Bande schienen zu fusionieren, und die dimeren Monomere, die ich durch Western Blot nachweisen wollte, waren sehr nahe beieinander.

Als ich das Gel das zweite Mal benutzt habe, ist der Marker im Sammelgel hängen geblieben. Der Trenn- und Stapelgelpuffer ist 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8. Die Polymerisation um meine Vertiefungen ist nicht sehr gleichmäßig und scheint ungleichmäßig zu sein. Ist es für native Gele üblich? Ich verwende frisch hergestelltes Aminopropyltriethoxysilan (APS) und eine neue Flasche Acrylamid und TEMED. Ich verwende 1% Detergens Deoxycholat (DOC) als kathodischen Puffer.


Hat jemand einen Ratschlag, was ich noch ändern kann?

Der vordefinierte Standard, den Sie verwenden, ist denaturiert und eignet sich nicht für die native Gelelektrophorese. Ihr bester Indikator während des Rennens ist der Tracking-Farbstoff. Sie können mehrere verwenden, wenn Sie während des Rennens eine Farbtrennung sehen möchten. Wenn Sie keine Standardmischung aus nativen Proteinen haben, können Sie Ihre eigene Mischung mit den gereinigten nativen Proteinen erstellen, die Sie zur Hand haben. Die Belastung ist ein wichtiger Faktor bei der Trennung, oft sogar wichtiger als die Größe.

A2 Das Einbringen eines nativen Gels nach dem Einstellen des SDS-Gels sollte kein Problem darstellen, solange Sie nicht alle Reagenzien und denaturierenden und reduzierenden Schritte wie DTT, βME, SDS, Kochen usw. auslassen. Wenn Ihr Puffer für SDS-PAGE gut funktioniert, sollte er in einem nativen Gel funktionieren, wenn Sie das SDS weglassen.

A3 Wie hoch ist die Acrylamidkonzentration Ihres Stapelgels? Ich benutze eine 3,5% Batterie, wenn ich ein natives Gel benutze. Es ist ein höherer Prozentsatz an Bisacrylamid als mein Laufgel. Es ist nach der Polymerisation trübe, die ich mit Riboflavin und Licht katalysiere. Es dauert eine Weile, bis eine vollständige Heilung erreicht ist, und ich muss die Vertiefungen mit einem Elektrodenkissen ausspülen, bevor ich das Gel einlege.

Ein Ja. Ist das zusätzliche Band höher oder niedriger auf dem Gel? Das Protein kann aggregiert oder abgebaut sein. Ihr Lysat enthält Proteasen und einige Inhibitoren haben eine kurze Haltbarkeit. Hast du diese Analyse schon einmal gemacht? Ihre zusätzliche Band könnte das gleiche Protein mit einer anderen posttranslationalen Modifikation sein.

Eine Stunde, um die Polymerisation zu vervollständigen, ist nicht ungewöhnlich. Die Polymerisation sollte innerhalb von 20 min in einem nativen Gel sichtbar werden. Es ist tatsächlich notwendig, das Gel länger zu polymerisieren, wenn die Gele für die Peptidsequenzierung laufen, da man sicherstellen muss, dass keine Acrylamidmonomere mehr übrig sind.

A2 Das Problem kann während der Vorbereitung des Gels auftreten. Mischen Sie vor dem Eingießen des Gels durch Inversion in eine ausreichend große Tube? Ich hatte klumpige Gele, als ich eine 15-μL-Lösung in ein 15-μL-Röhrchen mischte, also wechselte ich zu einem 50-μL-Röhrchen und das löste das Problem. Da Sie kein SDS in der Mischung haben, könnten Sie den Behälter wahrscheinlich kräftig schütteln oder vortexen, ohne Blasen zu erzeugen.

A3 Schütteln Sie die Lösung nicht kräftig! Dies ermöglicht den Einbau von atmosphärischen Gasen in die Lösung. Eines dieser Gase, Sauerstoff, wird die Polymerisation inhibieren. Verwirbeln oder Mischen durch Inversion ist ausreichend, wenn es akribisch ist.

Erwärmt sich Ihr Gel während der Polymerisation? Die Erwärmung kann Konvektionsströme in der Lösung verursachen, die nach der Polymerisation auftreten. Sehen Sie Wellen über den Frost oder nur an der Spitze der Brunnen? Wenn sie nur oben in den Vertiefungen liegen, lassen Sie das Gel länger aushärten.

A5 Wenn Ihr Gel in Ordnung aussieht, die Proben aber immer noch nicht richtig funktionieren, müssen Sie nachsehen Ihre Probe. Siehst du Streifen in der Probe? Haben Sie die Probe vor dem Laden geklärt? Verwenden Sie DOC in Ihrem Elektrodenpad, um sicherzustellen, dass die Probe löslich bleibt? Ihre Probe und Gel? Wenn nicht, Ihre Probe kann hetzen.